오늘은 진단에 활용된 크리스퍼 카스12 (CRISPR Cas12) 유전자 가위 기술에 대해 알아보겠습니다.
CRISPR Cas12a 시스템은 표적 DNA를 인식했을 때, 주변의 단일 가닥의 DNA를 비특이적으로 자르는 trans cleavage 활성을 이용하여 진단에 활용됩니다.
높은 민감도와 특이도를 보이는 기술이지만 등온 핵산 증폭 기술과 함께 활용되었을 때 더욱 효율이 좋아집니다.
본문에서는 등온 핵산 증폭 기술과 CRISPR Cas12a를 함께 활용한 기술들에 설명하도록 하겠습니다.
※ 본 글은 KAIST 생명화학공학 박사로 현직 국가연구소 연구원이 작성하였습니다.
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1. 진단에 활용되는 크리스퍼 카스12의 원리
CRISPR Cas12 시스템에 대한 구체적인 설명보다는 진단에 활용에 대해 서술할 예정이므로 간략하게 설명하도록 하겠습니다.
구체적인 원리에 대해 궁금하신 분은 아래 글을 보시면 좋습니다.
먼저 CRISPR Cas12a와 crRNA가 복합체를 형성하며, 그것은 crRNA가 인식할 수 있는 표적 DNA를 인식합니다.
Cas12a 시스템은 단일 가닥의 DNA나 PAM (protospacer-adjacent motif)을 가지는 이중 가닥의 DNA를 인식할 수 있습니다.
표적 DNA를 인식한 Cas12a 시스템은 두가지의 절단 방법이 활성화되며 cis cleavage에 의해 인식한 DNA를 절단되고 trans cleavage에 의해 주변에 있는 단일 가닥의 DNA를 비특이적으로 자르게 됩니다.
Cas12a가 진단에 활용될 때는 주로 trans cleavage 활성이 사용되며 주변에 있는 reporter 프로브를 자르게 됩니다.
※ 대표적으로 활용되는 Reporter는 최종 검출 방법이 형광일 경우에는 한쪽 말단에 형광 표지 물질을 사용하며, lateral flow assay가 검출 방법일 경우에는 한쪽 말단에 biotin을 붙여 설계합니다.
2. RPA와 CRISPR Cas12를 활용한 진단 기술
등온 핵산 증폭 기술 중 널리 활용되는 recombinase polymerase amplification (RPA) 기술과 CRISPR Cas12a을 동시에 사용하여 표적 핵산을 진단한 기술에 대해 알아보겠습니다.
DOI: https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2024.e28726
Shin, K., Seong, G. M., Yoo, J. R., & Kim, E. T. (2024).
Rapid and sensitive point-of-care diagnosis of human cytomegalovirus infection using RPA-CRISPR technology. Heliyon, 10(7).
RPA 기술에 대한 자세한 원리와 설명이 궁금하면 아래 글을 보시면 됩니다.
[1] 표적 핵산을 RPA 방법으로 증폭시켜 수없이 많은 이중 가닥 DNA 생성물을 얻습니다.
[2] 생성된 이중 가닥의 DNA는 PAM 염기서열을 포함하고 있기 때문에 Cas12a 시스템이 이를 인식하게 되고 trans cleavage 활성에 의해 주변에 있는 reporter를 자르게 됩니다.
[3] 먼저 형광 reporter를 사용한 경우 (5’ 말단에는 형광 표지 물질(FAM)을 3’ 말단에는 quencher를 사용한 reporter), 잘리게 되면 FAM과 quencher의 거리가 멀어져 형광을 내게 되고 그것을 형광 측정 모듈을 사용하여 측정합니다.
[4] 만약 LFA reporter를 사용한 경우 (5’ 말단에는 FAM을 3’ 말단에는 biotin을 사용한 reporter) , 잘리게 되면 5’에 FAM만 가지는 단일 가닥의 DNA가 생기게 되고 이것이 LFA strip의 test line에 도달하게 되어 band를 나타내게 됩니다.
※ LFA strip의 구체적인 원리에 대해서는 양이 많아져 본문에서는 설명하지 않겠습니다.
3. LAMP 기술과 크리스퍼 카스12 활용 진단 기술
다음으로는 또 다른 등온 핵산 증폭 기술인 loop-mediated isothermal amplification (LAMP) 기술과 Cas12a을 동시에 사용하여 표적 핵산을 진단한 기술에 대해 알아보겠습니다.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41587-020-0513-4
Broughton, J. P., Deng, X., Yu, G., Fasching, C. L., Servellita, V., Singh, J., … & Chiu, C. Y. (2020).
CRISPR–Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nature biotechnology, 38(7), 870-874.
[1] 표적 핵산을 LAMP 방법으로 증폭시켜 반복되고 긴 루프 형태의 DNA 생성물을 얻습니다.
[2] 긴 생성물의 이중 가닥 DNA 부분은 PAM 염기서열을 포함하고 있기 때문에 Cas12a 시스템이 이를 인식하게 되고 trans cleavage 활성에 의해 주변에 있는 reporter를 자르게 됩니다.
[3] RPA CRISPR Cas12a 기술에서 언급한 대로 형광 reporter를 사용하여 형광 검출을 할 수 있으며, FAM-biotin reporter를 사용하여 LFA 방식으로 검출할 수 있습니다.
4. 마치며
CRISPR Cas12a 시스템은 trans cleavage 활성을 활용하여 진단에 많이 활용되고 있습니다.
오늘은 대표적인 예시로 LAMP, RPA 기술을 활용한 논문에 대해서 알아봤지만, 다른 등온 핵산 증폭 기술과도 함께 사용되고 있습니다.
등온 핵산 증폭만을 활용했을 때 보다 훌륭한 민감도와 특이도를 얻을 수 있다는 장점이 있습니다.